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FISH技術(shù)作為非放射性檢測(cè)體系，具有以下優(yōu)點(diǎn)

1、熒光試劑和探針經(jīng)濟(jì)、安全；

2、探針?lè)€(wěn)定，一次標(biāo)記后可在兩年內(nèi)使用；

3、實(shí)驗(yàn)周期短、能迅速得到結(jié)果、特異性好、定位準(zhǔn)確；

4、FISH可定位長(zhǎng)度在1kb的DNA序列，其靈敏度與放射性探針相當(dāng)；

5、多色FISH通過(guò)在同一個(gè)核中顯示不同的顏色可同時(shí)檢測(cè)多種序列；

6、既可以在玻片上顯示中期染色體數(shù)量或結(jié)構(gòu)的變化，也可以在懸液中顯示間期染色體DNA的結(jié)構(gòu)。

　　FISH技術(shù)是一種非放射性分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，其基本原理是將直接與熒光素結(jié)合的寡聚核苷酸探針或采用間接法用生物素、地高辛等標(biāo)記的寡聚核苷酸探針與變性后的染色體、細(xì)胞或組織中的核酸按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則進(jìn)行雜交，經(jīng)變性—退火—復(fù)性—洗滌后即可形成靶DNA 與核酸探針的雜交體，直接檢測(cè)或通過(guò)免疫熒光系統(tǒng)檢測(cè)，最后在熒光顯微鏡下顯影，即可對(duì)待測(cè)DNA進(jìn)行定性、定量或相對(duì)定位分析。
　　FISH技術(shù)有以下幾點(diǎn)優(yōu)勢(shì)：

① 安全、快速、靈敏度高；

② 探針能較長(zhǎng)時(shí)間保存；

③ 多色標(biāo)記，簡(jiǎn)單直觀；

④ 可用于中期染色體及間期細(xì)胞的分析；

熒光原位雜交技術(shù)問(wèn)世于70年代后期，其曾多用于染色體異常的研究，近年來(lái)隨著FISH所應(yīng)用的探針鐘類的不斷增多，特別是全Cosmid探針及染色體原位抑制雜交技術(shù)的出現(xiàn)，使FISH技術(shù)不僅在細(xì)胞遺傳學(xué)方面，而且還廣泛應(yīng)用于腫瘤學(xué)研究，如基因診斷基因定位等 。原有的放射性同位素原位雜交技術(shù)存在著較多缺點(diǎn)，諸如每次檢驗(yàn)均 需重新標(biāo)記探針，已標(biāo)記的探針表現(xiàn)出明顯的不穩(wěn)定性，需要較和時(shí)間的曝光時(shí)間和對(duì)環(huán)境的污染等。在觀察結(jié)果時(shí)，需要較多的分裂進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。此外，由于放射性銀粒和染色體聚集的不同平面，可能引起計(jì)數(shù)上的誤差等。與之比FISH則具有：

①操作操作簡(jiǎn)便，探針標(biāo)記后穩(wěn)定，一次標(biāo)記后可使用二年；

②方法敏感，能迅速得到結(jié)果；

③在同一標(biāo)本上，可同時(shí)檢測(cè)幾種不同探針；

④不僅可用于分裂期細(xì)胞染色體數(shù)量或結(jié)構(gòu)變化的研究，而且還可用于間期細(xì)胞的染色體數(shù)量及基因改變的研究等特點(diǎn)。

熒光原位雜交技術(shù)是一種重要的非放射性原位雜交技術(shù)。它的基本原理是:如果被檢測(cè)的染色體或DNA纖維切片上的靶DNA與所用的核酸探針是同源互補(bǔ)的，二者經(jīng)變性-退火-復(fù)性，即可形成靶DNA與核酸探針的雜交體。將核酸探針的某一種核苷酸標(biāo)記上報(bào)告分子如生物素、地高辛，可利用該報(bào)告分子與熒光素標(biāo)記的特異親和素之間的免疫化學(xué)反應(yīng)，經(jīng)熒光檢測(cè)體系在鏡下對(duì)待測(cè)DNA進(jìn)行定性、定量或相對(duì)定位分析。

FISH選用的標(biāo)本可以是分裂期細(xì)胞染色體也可以是間期細(xì)胞．間期細(xì)胞可以是冰凍切片，也可以是細(xì)胞滴片或印片。生物素（Biotin），地高辛（digoxigenin），dinitrophenyl（DNP），aminoacetyl fluorine（AAF）等均可用于探針標(biāo)記。前兩者較為常用，通常采用切口平移法（Nick translation）或隨機(jī)引物法（Random Primer）對(duì)探針標(biāo)記。在已知探針DNA結(jié)構(gòu)及序列情況下也可采用PCR或RNA逆轉(zhuǎn)錄法標(biāo)探針。通常 用于Biotin 標(biāo)記的探針應(yīng)大于1000bp以下的探針，不易標(biāo)記成功。對(duì)PCR技術(shù)來(lái)標(biāo)記。近年來(lái)，Vysis 公司成功的生產(chǎn)些大片段的DNA探針（100-400kb）。由于控針較長(zhǎng)故可將熒光物質(zhì)直接標(biāo)記在核苷酸上，這不僅使雜交過(guò)程進(jìn)一步簡(jiǎn)化，而且雜交信號(hào)更強(qiáng)。如探針是具有重復(fù)序列的DNA或粘粒、YAC探針，在雜交液中加上用超聲斷碎的人體胎盤組織DNA或Cot DNA,以陰斷探針和染色質(zhì)之間非特異性的結(jié)合。

熒光信號(hào)在高壓汞燈產(chǎn)生的短波激發(fā)光下常引起熒光信號(hào)淬滅的發(fā)生，可將DAPI或PI稀釋于P-phenlenediomine的甘油緩沖液中。任何熒光顯微鏡均可用于觀察FISH信號(hào)，但對(duì)單拷貝探針的信號(hào)需要質(zhì)量較好的熒光顯微鏡。如采用雙色或多色濾光片可以同時(shí)觀察FITC、Texas-Red等多種顏色的FISH信號(hào)，不論是染色體還是單拷貝基因的FISH信號(hào)均可用高度敏感和高分辨率的彩色膠片攝取，也可通過(guò)CCD（charge coupled device）的照相系統(tǒng)或Laser Scanning Confocal Imaging System（激光掃描共焦成像系統(tǒng)）將攝取的信號(hào)儲(chǔ)存在計(jì)算機(jī)內(nèi)，經(jīng)軟件處理后，將信事情顯示在熒光屏上。由于有多種方法標(biāo)記DNA探針，故一次雜交可以同時(shí) 觀察多個(gè)探針的信號(hào)，如兩個(gè)不同的探針?lè)謩e用Biotin和Digoxigenin標(biāo)記，雜交后用avidin-FITC和抗-Dig-Texas-Red分別與探針上的Biotin 和Digoxigenin結(jié)合，應(yīng)用雙色濾光片，在顯微鏡下就可以同時(shí)看見(jiàn)帶有綠色熒光的FITC和紅色熒光的Texas-Red信號(hào)。同理，采用三種或三種以上不同的半抗原，如Biotin,DIG和DNP等標(biāo)記探針，然后用多種不同顏色的熒光素，如FITC（綠色），Rhodamine（紅色），AMA或Cascade Blue（藍(lán)色）等結(jié)合抗體進(jìn)行檢測(cè)，可同時(shí)得到多種不同顏色的熒光信號(hào)，如采用不同的排列組合，最多可同時(shí)檢測(cè)7種不同的探針。由于常規(guī)的熒光顯微鏡的照像系統(tǒng)，彩色膠片不易多次曝光，限制了這種聯(lián)合標(biāo)探針的應(yīng)用，使用Digital Imaging Camera System或CCD照像系統(tǒng)，先分別多次攝取灰色的影像關(guān)儲(chǔ)存在計(jì)算機(jī)內(nèi)，而后冠以人為的顏色，運(yùn)用軟件系統(tǒng)事例各次得到的影像，最終形成一個(gè)復(fù)合的多顏色的圖像。

此外，對(duì)已做過(guò)G顯帶的染色體片子用75%酒精或甲醇褪色后，可再做FISH這樣可更清晰的辨認(rèn)各條染體及染色色體結(jié)構(gòu)異常（包括某些復(fù)雜的易位，插入，倒位等）FISH和G顯帶技術(shù)結(jié)合不僅可以用新近G帶處理過(guò)的片子，而且還可用陳舊的G帶片子。因此，F(xiàn)ISH技術(shù)可成功的幫助細(xì)胞遺傳學(xué)家做出回顧性分析。

FISH技術(shù)和RFLP（Restrict Fragment Lenth Polymorphysim）結(jié)合，可以更精確地描述原必于染色體長(zhǎng)短臂等結(jié)構(gòu)改變和染色體梳型或復(fù)制片段的性質(zhì)。FISH和細(xì)胞免疫化這技術(shù)結(jié)合，可以同時(shí)用多種顏色反應(yīng)檢測(cè)不同的核苷酸鏈和蛋白質(zhì)，這樣可以在單個(gè)細(xì)胞內(nèi)同時(shí)找到基因的位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄和翻譯和產(chǎn)物，有助于對(duì)核甙酸結(jié)構(gòu)與功能以及基因表達(dá)產(chǎn)物之間關(guān)系的研究。在基因圖譜繪制中，F(xiàn)ISH和Linkage mapping結(jié)合起來(lái)，即使對(duì)具有高度多形態(tài)的基因位點(diǎn)也能較精確地定下來(lái)。

在細(xì)胞遺傳學(xué)檢查中，重復(fù)序列的探針應(yīng)用最多，它們是α衛(wèi)星DNA、β-衛(wèi)星DNA和經(jīng)典衛(wèi)星DNA探針。α衛(wèi)星DNA探針主要檢測(cè)人染色體的著絲粒。β衛(wèi)星DNA位于頂端著絲粒染色體及號(hào)染色體的異染色體質(zhì)周圍.經(jīng)典衛(wèi)星DNA（classic-saiellite DNA）有著AATGG短片段重復(fù)，位于染色體1、9、15、16和Y染色體長(zhǎng)臂異染色質(zhì)周圍。后兩種探針除去可用于染色體數(shù)目檢查外，還可用于上述部位精細(xì)改變的檢查。三種探針產(chǎn)生的熒光信號(hào)都在染色體著絲?；蚋剑虼顺Ｓ糜阼b定，羊水細(xì)胞可不培養(yǎng)直接作FISH檢查，發(fā)現(xiàn)在21三體（Down氏綜合征）、18三體（Edward綜合征）、13體（Patau 綜合征）、45XO（Turner氏綜合征）和47XXY（Klinfelter綜合征）。

FISH在白血病方面和應(yīng)用較為方泛的是慢性粒細(xì)胞白血病bcr/abl易位DNA探針，采用Digoxigenin標(biāo)記于22號(hào)染色體上的bcr基因，用Biotin標(biāo)記位于9號(hào)染色體上的Abl基因，然后用紅綠二種不同顏色的熒光素檢測(cè)，慢粒常有染色體易位t（9；22）（q34；q11）而引起bcr和Abl基因的融合，這時(shí)不需要檢測(cè)分裂中期細(xì)胞，在間期細(xì)胞中就可以見(jiàn)到二種顏色訊號(hào)的混合，從而可以確定是Ph陽(yáng)性細(xì)胞。這特別適合化療后緩解的CML，極易發(fā)現(xiàn)殘存的白血病細(xì)胞。其它如t（15；17）易位DNA探針，t（18；21）易位DNA探針?lè)謩e可用于急性早幼粒白血病（APL）和急性粒細(xì)胞白血?。ˋML）的診斷。此外在白血病的診斷方面，還有等位17號(hào)染色體長(zhǎng)臂iso(17q),16號(hào)染色體長(zhǎng)臂間倒位inv（16）探針等，都有商業(yè)出售。

在實(shí)體腫瘤方面，應(yīng)用較為廣泛的是HER-2/neu基因探針。乳腺癌細(xì)胞中Her/2-neu基因的擴(kuò)增常預(yù)示著患者預(yù)后較差。在FISH技術(shù)之前的所有測(cè)定基因擴(kuò)增的方法，都是采用經(jīng)典的分子生物學(xué)方法South blotting等），但這些方法與FISH相比，不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且也不可能在細(xì)胞水平上觀察到基因擴(kuò)增的狀態(tài)。FISH技術(shù)的更大優(yōu)點(diǎn)是可以在間期細(xì)胞核上觀察到DNA擴(kuò)增的直接證據(jù)，而且間期細(xì)胞核所顯示出的擴(kuò)增DNA熒光信號(hào)其數(shù)量多少及熒光強(qiáng)度常與DNA擴(kuò)增的水平有關(guān)。1998年美國(guó)政府FDA批準(zhǔn)了作為基因治療的一種單克隆抗體Herceptin，可配合化療來(lái)治療部分晚期轉(zhuǎn)移性乳腺癌病人，約25-30%的乳腺癌病人有HER-2/neu基因的擴(kuò)增和/或過(guò)度表達(dá)。這部分病人適合Herceptin治療、FDA在此前一些時(shí)候批準(zhǔn)了Vysis公司的HER-2/neu基因DNA探針在乳腺癌臨床診斷上的應(yīng)用。HER-2/neu基因的擴(kuò)增或過(guò)表達(dá)也見(jiàn)于卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、涎腺腫瘤及胃癌等惡 性腫瘤?？梢灶A(yù)，在不久的將來(lái)Herceptin和HER-2/neu基因DNA探針可用于這些腫瘤的治療和診斷。其它一些實(shí)體瘤的腫瘤的腫瘤基因的探針如N-myc,C-myc,CyclinD1等雖有商業(yè)出售，但目前還未用于臨床。

染色體x,y,21,18和13的數(shù)量變化常與先天性疾病有關(guān)。采用染色體著絲粒重復(fù)序列DNA作為探針，可以確定分裂細(xì)胞或間期細(xì)胞這些染色體的數(shù)目止，如采用21號(hào)染色體的涂抹（painting）探針，根據(jù)標(biāo)記區(qū)域的大小可檢測(cè)出Down氏綜合征的發(fā)生。

實(shí)體腫瘤的染色體研究比較困難，這是由于獲取足夠量的分裂期腫瘤細(xì)胞比較困難。使用染色體著絲特異探針，對(duì)間期細(xì)胞進(jìn)行染色體數(shù)量變異分析，可獲得較好的結(jié)果。因此FISH技術(shù)十分有助于腫瘤細(xì)胞遺傳細(xì)胞遺傳學(xué)的研究。Hopman采用FISH技術(shù)研究膀胱癌，發(fā)現(xiàn)9號(hào)染色體的丟失。FISH檢測(cè)的結(jié)果與流式細(xì)胞儀分析的結(jié)果完全一致。Waldman等發(fā)現(xiàn)染色體數(shù)目的改變和腫瘤的分化及分期有著密切關(guān)系，如7號(hào)染色體嗇常見(jiàn)于有較高的Brdard分級(jí)和有較高的PCNA標(biāo)記指數(shù)的晚期、惡性度高的腫瘤。Waldman認(rèn)為這一現(xiàn)象可涉及到7號(hào)染色體上某些特殊基因的表達(dá)增加或被抑制。采用多種染色體探針，以不同的顏色標(biāo)記，更適合于實(shí)體腫瘤染色體數(shù)目改變的異質(zhì)性研究。

對(duì)于G或Q顯帶難以確定的染色體結(jié)構(gòu)改變，運(yùn)用FISH技術(shù)可以幫助解決。許多不能歸類的標(biāo)記染色體，F(xiàn)ISH技術(shù)可以確定畸變的來(lái)源，如Miura等報(bào)告21例非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的染色體改變，其中一例有2個(gè)標(biāo)記染色體，用FISH檢測(cè)后證實(shí)是來(lái)自9號(hào)染色體的短臂梁色體上微細(xì)帶的丟失，普通顯帶常不易發(fā)現(xiàn)，用特定的基因探針檢測(cè)時(shí)，在正常應(yīng)該有熒光信號(hào)的部位如不出現(xiàn)信號(hào)，表示有染色體的丟失。Lux等用Ankyrin基因作探針，檢測(cè)遺傳性球殂紅細(xì)胞增多癥病人的染色體和間期細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)有這個(gè)基因的缺失。Taguchi等采用靠近3p21帶附近的6個(gè)不同位點(diǎn)的探會(huì)，比較異常和正常3號(hào)染色體，確定胸膜間皮瘤有3p21帶的缺失并推測(cè)這個(gè)區(qū)域可能存在重要的抑癌基因，為了進(jìn)一步的分子生物學(xué)研究提供了重要線索。選擇按一定順序排列的基因探針，可以幫助確定染色體倒位，尤其是臂間倒位的性質(zhì)，如急性白血病有16號(hào)染色體的倒位，選擇兩個(gè)分別位于斷裂點(diǎn)近端和遠(yuǎn)端的粘粒探針，同時(shí)用16號(hào)染色體著絲位探針，正常細(xì)胞熒光信號(hào)的次序是：粘粒-粘粒-著絲粒，而白血病細(xì)胞的信號(hào)的次改變?yōu)檎沉?著絲粒-粘粒。

雜交細(xì)胞通常是含有單個(gè)人類染色體嚙齒動(dòng)物細(xì)胞。這種雜交細(xì)胞常用于繪制基因圖譜或生產(chǎn)單個(gè)染色體特DNA庫(kù)。雜交細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中，人體染色體極易丟失或發(fā)生染色體重排，因此，需要對(duì)雜交細(xì)胞定期進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)檢查，采用人體組DNA作為探針或相應(yīng)人體染色體涂抹探針，可以很主便的檢測(cè)這些改變。

采用FISH技術(shù)，不僅可以直接確定某一DNA鏈在染色體上的位置，而且誚用多種顏色熒光素的標(biāo)記控針，還提供了一個(gè)簡(jiǎn)單的確定基因順序的方法?？捎貌煌伾珶晒馑貥?biāo)記兩個(gè)不同的DNA鏈，而且他們?cè)谌旧w上的距離大于1Mbp時(shí)，可以依據(jù)不同探針信號(hào)的排列關(guān)系分辨他們?cè)谌旧w上的順序。采用5-Burd處理的細(xì)胞，可以獲得高分辨顯帶的染色體，從而增加DNA鏈標(biāo)記到染色體上的分辨能力。如果使用間期細(xì)胞，兩個(gè)DNA鏈的距離可以縮短至50Kbp，這個(gè)間距是染色體上的分辨距離的二十分之一。不同探針的次序可以通過(guò)測(cè)量其間期細(xì)胞的距離來(lái)確定。

確定DNA鏈在染色體上精細(xì)位置，適用于檢查某些特殊的染色體易位和缺失，如涉及11號(hào)染色體q23的易位常見(jiàn)于急性白血t（4；11）見(jiàn)于急性淋巴細(xì)胞白血病（ALL），t（6；11)，5（9；11）見(jiàn)于急性粒細(xì)胞白血?。ˋML），t（11；19）見(jiàn)于急淋和急粒兩種白血病。

標(biāo)記同一DNA鏈與不同種必細(xì)胞的染色體雜交，可以找出不同種屬之間的同源基因以及基因在染色休上的位置，從而了解種屬之間的進(jìn)化關(guān)系。

DNA擴(kuò)增通常表現(xiàn)為異常的顯帶區(qū)域（ABRS）或異染質(zhì)區(qū)（HSRS）以及無(wú)著絲微小體（DM），這些基因擴(kuò)增的細(xì)胞遺傳學(xué)表現(xiàn)在許多惡性腫瘤中。搞清楚腫瘤細(xì)胞中物定DNA鏈（基因）的擴(kuò)增，有助于了解腫瘤的惡性增生過(guò)程。在腫留細(xì)胞中某些腫瘤因(Oncogene)的擴(kuò)增，可作為預(yù)測(cè)腫瘤進(jìn)展及預(yù)后的臨床指征。如FISH能有效地在染色體上定位擴(kuò)增的特定DNA，特別是當(dāng)細(xì)胞遺傳學(xué)發(fā)現(xiàn)在HSR或ABRS來(lái)源及位置，推測(cè)可能擴(kuò)增的腫瘤基因，從而有目的檢測(cè)某些基因，并能很快得到直接清晰的基因擴(kuò)增的信息。Cherif等在結(jié)腸腺癌細(xì)胞中，采用FISH技術(shù)發(fā)現(xiàn)C-myc的擴(kuò)增，而且C-myc擴(kuò)增鏈?zhǔn)侵嘏旁?9號(hào)染色體的長(zhǎng)臂上。染色體上策細(xì)帶的丟失，普通顯帶不易發(fā)現(xiàn)，用特定的基因探針檢測(cè)時(shí)，在正常應(yīng)該有熒光信號(hào)的部位如不出現(xiàn)信號(hào)，表示有染色體的丟失。用Ankyrin基因作探會(huì)，檢測(cè)遺傳性球殂紅細(xì)胞增多癥病人的染色體和間期細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)有這個(gè)基因的缺失。有學(xué)者用FISH技術(shù)在37例B細(xì)胞淋巴瘤中發(fā)現(xiàn)21例（56.8%）存在6q23-24的缺失，故認(rèn)為這一改變對(duì)淋巴瘤診斷有實(shí)際應(yīng)用值。